Contenido
- Enzimas de restricción y sitios de restricción
- La orientación correcta
- La ligadura de extremos adhesivos requiere menos ADN
- Diferentes enzimas pueden dar el mismo final pegajoso
La clonación molecular es un método biotecnológico común con el que todos los estudiantes e investigadores deberían estar familiarizados. La clonación molecular utilizando un tipo de enzima llamada enzima de restricción para cortar el ADN humano en fragmentos que luego pueden insertarse en el ADN plasmídico de una célula bacteriana. Las enzimas de restricción cortan el ADN bicatenario a la mitad. Dependiendo de la enzima de restricción, el corte puede dar como resultado un extremo pegajoso o un extremo romo. Los extremos adhesivos son más útiles en la clonación molecular porque aseguran que el fragmento de ADN humano se inserte en el plásmido en la dirección correcta. El proceso de ligadura, o la fusión de fragmentos de ADN, requiere menos ADN cuando el ADN tiene extremos adhesivos. Por último, múltiples enzimas de restricción de extremo adhesivo pueden producir el mismo extremo adhesivo, aunque cada enzima reconoce una secuencia de restricción diferente. Esto aumenta la probabilidad de que su región de ADN de interés pueda ser cortada por enzimas finales adhesivas.
Enzimas de restricción y sitios de restricción
Las enzimas de restricción son enzimas que cortan las secuencias específicas reconocidas en el ADN bicatenario y cortan el ADN a la mitad en esa secuencia. La secuencia reconocida se llama sitio de restricción. Las enzimas de restricción se denominan endonucleasas porque cortan el ADN bicatenario, que es como normalmente existe el ADN, en ubicaciones que se encuentran entre los extremos del ADN. Hay más de 90 enzimas de restricción diferentes. Cada uno reconoce un sitio de restricción distinto. Las enzimas de restricción escinden sus respectivos sitios de restricción 5.000 veces más eficientemente que otros sitios que no reconocen.
La orientación correcta
Las enzimas de restricción vienen en dos clases generales. Cortan el ADN en extremos adhesivos o extremos romos. Un extremo adhesivo tiene una región corta de nucleótidos, los bloques de construcción de ADN, que no están emparejados. Esta región no emparejada se llama voladizo. Se dice que el voladizo es pegajoso porque quiere y se emparejará con otro extremo adhesivo que tenga una secuencia de voladizo complementaria. Los extremos pegajosos son como gemelos perdidos hace mucho tiempo que buscan abrazarse fuertemente una vez que se encuentran. Por otro lado, los extremos romos no son pegajosos porque todos los nucleótidos ya están emparejados entre las dos cadenas de ADN. La ventaja de los extremos adhesivos es que un fragmento de ADN humano solo puede caber en un plásmido bacteriano en una dirección. Por el contrario, si tanto el ADN humano como el plásmido bacteriano tienen extremos romos, el ADN humano puede insertarse cabeza a cola o cola a cabeza en el plásmido.
La ligadura de extremos adhesivos requiere menos ADN
Aunque el ADN con extremos de palo es más fácil de encontrar debido a su "adherencia", ni los extremos pegajosos ni los extremos romos pueden fusionarse en una pieza continua de ADN. La formación de una pieza continua de ADN que está completamente unida requiere una enzima llamada ligasa. Las ligasas conectan la columna vertebral de los nucleótidos en los extremos pegajosos o romos, dando como resultado una cadena continua de nucleótidos. Debido a que los extremos adhesivos se encuentran más rápido debido a su atracción mutua, el proceso de ligadura requiere menos ADN humano y menos ADN plasmídico. Los extremos romos del ADN y los plásmidos tienen menos probabilidades de encontrarse, y por lo tanto la ligadura de los extremos romos requiere que se coloque más ADN en el tubo de ensayo.
Diferentes enzimas pueden dar el mismo final pegajoso
Los sitios de restricción están ubicados en todo el genoma de los organismos, pero no están espaciados de manera uniforme. En los plásmidos, pueden diseñarse para ubicarse uno al lado del otro. Los científicos que quieran cortar un fragmento de ADN humano del genoma humano deben encontrar sitios de restricción que se encuentren delante y detrás de la región del fragmento. Además de garantizar que se inserte un fragmento de ADN en la dirección correcta, las diferentes enzimas de los extremos adhesivos pueden crear el mismo extremo adhesivo a pesar de que reconocen diferentes secuencias de restricción. Por ejemplo, BamHI, BglII y Sau3A tienen diferentes secuencias de reconocimiento pero producen el mismo extremo adhesivo GATC. Esto aumenta la probabilidad de que haya sitios de restricción de extremo adhesivo que flanqueen su gen humano de interés.