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La cromatografía líquida de alto rendimiento es una técnica para el análisis de laboratorio de una mezcla. Es un tipo eficiente de cromatografía que utiliza alta presión, en lugar de simplemente gravedad, para impulsar una muestra de una mezcla a través de una columna. Se inyecta una muestra, luego una bomba que contiene altas cantidades de presión ayuda a mover la muestra a lo largo de una columna empaquetada, donde se separa en componentes individuales. Esta separación es luego analizada por un detector para obtener resultados.
Sitio de inyección
Para inyectarse en una HPLC, primero se debe disolver una muestra en un disolvente líquido polar, preferiblemente uno con espectros de HPLC conocidos para que sus datos se puedan distinguir de las muestras. La solución líquida que contiene la muestra se coloca en el instrumento y se envía a la columna. La ubicación real del sitio de inyección depende de la marca de instrumentos. En la mayoría de los casos, el proceso de inyección es automático, pero en algunos casos un trabajador de laboratorio debe inyectar la muestra con una pequeña aguja de jeringa.
Componente de la bomba
El componente de la bomba de la unidad HPLC es necesario porque proporciona la presión que impulsa la muestra a través de la columna. La resistencia de la bomba varía, pero una potente puede producir una presión de hasta 6,000 psi, o libras por pulgada cuadrada, que se aplica después de que se inyecta la muestra. Esto permite que la muestra pase a través de la columna de manera más rápida y eficiente que si goteara usando solo la fuerza de la gravedad.
Descripción de columna
El aumento de la velocidad de una muestra que pasa a través de la columna por una bomba permite el uso de un tipo diferente de columna que los utilizados en la cromatografía líquida simple. El material de empaque en la columna puede tener un tamaño de partícula mucho más pequeño, lo que aumenta el área de superficie y, por lo tanto, ayuda a las interacciones de la muestra con la columna. La mayoría de las columnas de HPLC funcionan mediante polaridad. La muestra se disuelve en un solvente polar y la columna está compuesta en gran parte de hidrocarburos no polares. Las partes polares de la molécula de muestra pasan a través de la columna muy rápidamente porque están interactuando principalmente con el solvente, mientras que los componentes no polares de las muestras permanecen en la columna, formando interacciones débiles con los componentes de la columna. Por lo tanto, los componentes de las muestras salen de la columna en orden de más polar a más no polar.
Función de detector
Los detectores también varían según el tipo de instrumento de HPLC que se utilice. Sin embargo, la mayoría funciona de la misma manera básica. Una fuente de luz ultravioleta brilla en los componentes de muestra separados a medida que salen de la columna. La mayoría de los compuestos orgánicos absorben una cierta cantidad de luz, por lo que a medida que pasan por el haz de luz aplicado, un detector puede recoger la cantidad de luz absorbida. El detector también registra el tiempo de retención de los componentes en función del orden en que salen de la columna. Esta salida se puede analizar en función del área de pico para determinar la naturaleza exacta de los componentes de las muestras.