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La tinción de Gram es un procedimiento de tinción diferencial que muestra qué bacterias son Gram-positivas o Gram-negativas en función de su color de tinción. El alcohol acetona es un reactivo utilizado en este proceso para proporcionar la diferenciación de color. Las bacterias grampositivas tienen una capa gruesa de peptidoglucano y se tiñen de púrpura, mientras que los microorganismos gramnegativos tienen una capa de peptidoglucano poco o nada y se tiñen de rosa.
Violeta cristalina manchada primaria
Una vez que se prepara un portaobjetos de muestra bacteriana, se usa cristal violeta para teñir primero la muestra. En este punto, las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas aparecerán de color púrpura. Por lo general, el cristal violeta se aplica en el portaobjetos durante 30 segundos antes de lavar cualquier exceso de mancha con agua. El cristal violeta puede adherirse un poco a las capas de peptidoglicano, por lo que no toda la mancha primaria se lavará con el agua.
Mordiente-yodo
Luego se agrega yodo a la muestra durante un minuto. Actúa como un mordiente, que sirve para fijar tintes en un proceso de tinción. El yodo realiza esta función uniéndose al cristal violeta y creando un complejo insoluble que se adhiere mucho mejor a la capa gruesa de peptidoglicano que se encuentra en las células bacterianas Gram positivas que solo el cristal violeta solo. No hay un paso de lavado con agua después de agregar el yodo.
Descolorizer-Alcohol
Se puede usar acetona o alcohol etílico como agente decolorante. El alcohol disuelve los lípidos que se encuentran en la membrana celular externa de las bacterias Gram negativas, lo que permite que el complejo cristal violeta-yodo se filtre fuera de la capa más delgada de peptidoglicano. El alcohol se agrega durante 10 a 20 segundos; se vierte en el portaobjetos hasta que se elimine todo el yodo y la escorrentía sea incolora. En este punto del proceso de tinción de Gram, las bacterias Gram-negativas son incoloras, mientras que las bacterias Gram-positivas aún retienen el cristal violeta. Una vez terminado, el portaobjetos debe enjuagarse con agua para detener el efecto decolorante.
Counterstain-Safranin
Luego se agrega safranina para aumentar la visibilidad y el contraste con las bacterias Gram negativas incoloras. La mancha hace que estas bacterias se vean rosadas bajo el microscopio. Dado que la mancha se agrega a toda la muestra, también mancha las bacterias Gram positivas, pero la más oscura de la violeta cristalina oculta el color rosa safranina más claro. Una vez que la muestra del portaobjetos se ha inundado con safranina durante aproximadamente un minuto, se usa agua para eliminar el exceso de manchas que no se adhirieron a las células bacterianas.