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La espectrofotometría es una herramienta invaluable en química y biología. La idea básica es simple: diferentes sustancias absorben mejor la luz / radiación electromagnética en algunas longitudes de onda que en otras. Es por eso que algunos materiales son transparentes, mientras que otros son de color, por ejemplo. Cuando brillas la luz de una longitud de onda dada a través de una solución, cuanto mayor sea su concentración, más luz absorberá. Para calcular la concentración, debe comparar su lectura con las lecturas de los estándares de concentración conocida. El siguiente procedimiento es un procedimiento bastante genérico escrito con un laboratorio de enseñanza de química en mente, pero también se puede modificar para otros entornos.
Como siempre cuando trabajas en un laboratorio, ponte las gafas, los guantes y el abrigo de manga larga para garantizar tu propia seguridad.
Aprieta el bulbo de goma para vaciarlo de aire, luego colócalo sobre tu pipeta graduada y deja que el bulbo se relaje para que succione agua en la pipeta. Luego, retire la bombilla y tape la parte superior de la pipeta con el dedo; esto sellará la pipeta para que la solución en el interior no fluya hasta que retire el dedo. Levante ligeramente el borde de su dedo para dejar que salga un poco de solución de la pipeta, hasta alcanzar el volumen deseado. Practique con un poco de agua y un vaso de precipitados para tener una idea de cómo funciona la pipeta graduada. El enlace en la sección de Recursos tiene un clip de película para mostrarle cómo usar una pipeta en caso de que nunca haya trabajado con una antes.
Etiquete 5 tubos de ensayo como estándares 1-5. Puede etiquetarlos con cinta adhesiva y un bolígrafo o con un marcador de borrado en seco.
Elija cinco concentraciones para sus estándares. Desea que las concentraciones estándar estén separadas entre sí por aproximadamente el mismo intervalo, por ejemplo, 0.1 molar, 0.2 molar, 0.3 molar, etc., y en aproximadamente el mismo rango que espera que sea su desconocido. Por el momento, use las siguientes cinco concentraciones, pero recuerde que deberá modificarlas cuando realice su propio experimento:
Estándar 1: 0.1 molar Estándar 2: 0.2 molar Estándar 3: 0.3 molar Estándar 4: 0.4 molar Estándar 5: 0.5 molar
Luego, tome la solución estándar 1 molar y agregue las siguientes cantidades a los tubos de ensayo 1-5. Recuerde, estas cantidades se calculan utilizando las concentraciones enumeradas anteriormente, por lo que es posible que deba modificarlas según sea necesario cuando realice su propio experimento.
Estándar 1: 0.8 mililitros Estándar 2: 1.6 mililitros Estándar 3: 2.4 mililitros Estándar 4: 3.2 mililitros Estándar 5: 4 mililitros
Enjuague la pipeta graduada, luego transfiera las siguientes cantidades de agua desionizada:
Estándar 1: 7.2 mililitros Estándar 2: 6.4 mililitros Estándar 3: 5.6 mililitros Estándar 4: 4.8 mililitros Estándar 5: 4.0 mililitros
Básicamente, la idea es llevar la cantidad de solución en cada tubo hasta 8 mililitros.
Tape cada uno de los tubos estándar con parafilm e inviértalos para mezclar.
Marque otros cinco tubos de ensayo como "Desconocido 1-5". Agregue las mismas cantidades de su solución desconocida o de prueba a cada una que utilizó con la solución 1 molar para los estándares. En otras palabras, el desconocido 1 contendrá 0.8 mililitros de solución de prueba y 7.2 mililitros de agua, el desconocido 2 contendrá 1.6 mililitros de solución de prueba y 6.4 mililitros de agua, y así sucesivamente.
Cubra cada una de las incógnitas con parafilm e invierta cuidadosamente para mezclar.
Encienda el espectrofotómetro y permita que se caliente. El tiempo necesario dependerá del modelo y el fabricante.
Establezca la longitud de onda en el espectrofotómetro. La longitud de onda dependerá del tipo de químico en su experimento. Por ahora, suponga 500 nm, aunque recuerde que tendrá que cambiar esto para diferentes experimentos.
Calibre su espectrofotómetro. El procedimiento de calibración variará según el dispositivo que esté utilizando. Para el Spectronic 20, un modelo común en los laboratorios de enseñanza, primero ajustará la máquina para que lea "0 por ciento T" cuando no haya una cubeta cargada, luego ajústela para que lea "100% T" cuando una cubeta en blanco contenga desionizada solo se carga agua. Estos procedimientos pueden variar según el tipo de máquina que esté utilizando, por lo tanto, consulte las instrucciones del fabricante para obtener más detalles.
Después de calibrar la máquina, tome el tubo de ensayo estándar 1 y vierta el contenido en una cubeta limpia hasta que lleguen a la línea de llenado. Limpie la cubeta con una toallita para quitar cualquier dedo u otra suciedad. Inserte la cubeta en el espectrofotómetro y registre la lectura "% T".
Repita este procedimiento para las 10 muestras. ASEGÚRESE de limpiar la cubeta entre muestras para asegurarse de que sus resultados sean lo más precisos posible.
Tome los resultados para sus estándares e ingréselos en una hoja de cálculo / programa de gráficos como Excel u OpenOffice.
Usando el programa de hoja de cálculo, divida el 100 por ciento por cada uno de los valores "% T" para los estándares, luego tome el registro del resultado. Este cálculo te dará la absorbancia. Si ingresa la fórmula, su programa de hoja de cálculo hará el cálculo por usted.
Ejemplo: si el% T es 50.6, la fórmula que ingrese en el programa de hoja de cálculo sería la siguiente:
registro (100 / 50.6)
El programa de hoja de cálculo hará la aritmética.
Haga lo mismo para los cinco valores desconocidos / experimentales.
Grafique los valores de absorbancia para los cinco estándares, con concentración en el eje xy absorbancia en el eje y. Usando el programa de hoja de cálculo, ajuste una ecuación lineal a este gráfico. La ecuación tendrá la forma y = mx + b. La mayoría de los programas de hoja de cálculo tendrán una función de regresión lineal. Consulte el manual del usuario de su programa de hoja de cálculo para obtener detalles sobre cómo usar la función de regresión lineal.
Tome la ecuación para la línea de mejor ajuste de su programa de hoja de cálculo y resuélvala para y restando b de ambos lados y dividiendo ambos lados por m. El resultado se verá así:
(y - b) / m = x
donde bym son valores encontrados por su programa de hoja de cálculo.
Verifique sus valores de absorbancia para las incógnitas y elija tres que se encuentren en el mismo rango que los estándares. Use estos tres valores de absorbancia para sus cálculos restantes. Si los cinco caen en el mismo rango que los estándares, puede usar los cinco en su lugar, pero debe usar al menos tres.
Inserte cada uno de los tres valores de absorbancia en su ecuación en lugar de y. Recuerde que su ecuación estaba en la siguiente forma:
(y - b) / m = x
Por lo tanto, querrá insertar el valor de absorbancia para cada desconocido en la ecuación en lugar de y, luego calcular x. Puede usar el programa de hoja de cálculo para hacer este cálculo por usted y hacerlo más rápido. Ahora ha calculado la concentración de la sustancia química de interés en tres de sus incógnitas diluidas. Sin embargo, la solución original se diluyó para preparar estas incógnitas, por lo que ahora debe trabajar hacia atrás y calcular la concentración de la solución original en función del factor de dilución.
Cada muestra desconocida que insertó en el espectrofotómetro se diluyó en una cantidad diferente. En consecuencia, ahora debe dividir la concentración que ha calculado en función de la absorbancia de cada lectura desconocida por lo siguiente:
Desconocido 1: dividir por 0.1 Desconocido 2: dividir por 0.2 Desconocido 3: dividir por 0.3 Desconocido 4: dividir por 0.4 Desconocido 5: dividir por 0.5
Sin embargo, recuerde que estas cifras se basan en el supuesto de que está utilizando las diluciones descritas anteriormente. Recuerde cambiar estos valores si diluyó sus muestras en una cantidad diferente.
Sume sus resultados y divídalos por la cantidad de resultados. Esto te dará un promedio. Informe este número como su hallazgo para la concentración de la solución original.