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El azul genético de una célula está codificado dentro de su material genético, o ADN. Como el ADN nunca abandona el núcleo de la célula, para que esta información ingrese al citoplasma donde residen otras proteínas y componentes bioquímicos, es necesario transcribir primero el ADN en ARN mensajero (ARNm o ARN poli (A)). Este ARNm luego se traduce en proteínas que llevan a cabo muchas funciones de la célula. Para detectar o cuantificar ARNm muy raros, hacer sondas para microarrays o construir bibliotecas de moléculas de ADN complementarias, debe aislarse ARNm. Sin embargo, la extracción de ARN total (es decir, todo el ARN en una célula) y el posterior aislamiento de ARNm no son procesos mutuamente excluyentes; el primero debe realizarse para que se extraiga el ARNm.
Aislamiento de ARNm del ARN total
Homogeneización de TRIzol: el ARN total incluye todos los ARNm, ARN de transferencia, ARN ribosómico y otros ARN no codificantes. Para separarlos de otros componentes celulares, la célula se abre primero para liberar su contenido. Esto se hace resuspendiendo las células granuladas por centrifugación (girando a altas velocidades) en reactivo TRIzol (Life Technologies). Otras versiones de TRIzol (como el reactivo TRI de Ambion) funcionan de manera similar.
Aislamiento total de ARN: se utiliza una serie de centrifugaciones para separar los diferentes componentes (proteínas, ADN, ARN) de la célula en capas o fases dentro de la suspensión. La fase superior, de color amarillo, está compuesta de grasa y puede desecharse. La fase deseada se tiñe de rojo, contiene el ARN total y se retiene. Después de realizar una extracción con fenol-cloroformo y una serie de lavados con alcohol usando isopropanol y etanol, el ARN puede sedimentarse para el aislamiento de ARNm. Agregue inhibidores de RNasa para evitar que esta enzima degrade el ARN total.
Extracción de ARNm: es común usar un kit para aislar ARNm, ya que los protocolos de laboratorio caseros no generan grandes cantidades de ARNm altamente purificados. Los kits comerciales incluyen FastTrack 2.0 de Invitrogen o el kit de aislamiento de ARNm puro Poly (A) de Ambion. Estos pasos básicos son comunes a tales kits:
a) Mezcle el tampón de lisis inhibido por RNasa provisto en el kit con hasta 300 microlitros de ARN total.
b) Calentar durante 5 minutos a 65 grados Celsius y luego enfriar inmediatamente la muestra en hielo durante un minuto.
c) Mezcle esto con cloruro de sodio 0.5M y luego disuelva completamente Oligo dT (ácido oligodesoxitimidílico) en esta muestra.
d) Centrifugue esta muestra y recupere el sobrenadante, que se lava varias veces en una serie de tampones de unión y bajos en sal proporcionados en los kits.
e) Eluir ARNm varias veces hasta obtener un volumen especificado por el kit (por ejemplo, 500 microlitros).
f) Precipitar el eluido mediante acetato de sodio y precipitación con etanol. Vuelva a suspender en hasta 20 microlitros de agua tratada con dietilpirocarbonato (DEPC).
g) Almacenar a -80 grados Celsius y verificar la calidad y cantidad por espectrofotometría.