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La cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) es una técnica de laboratorio utilizada para separar e identificar compuestos. Es un tipo de cromatografía en columna que se basa en diferentes polaridades de compuestos en una solución para separarlos. La HPLC difiere de la cromatografía en columna estándar porque usa presión para forzar la solución a través de la columna más rápidamente y, por lo tanto, produce resultados más rápidos y, a veces, más precisos. El objetivo es separar los compuestos en la columna y hacer que salgan por separado.
Coelución
Debido a la velocidad de HPLC y su dependencia de diferentes polaridades de compuestos, dos compuestos con estructura y polaridades similares pueden salir del aparato de cromatografía al mismo tiempo o casi al mismo tiempo. Esto se conoce como coelución. La coelución hace que sea difícil determinar exactamente qué porción de la mezcla eluyó en qué punto.
Compuestos adsorbidos
La HPLC generalmente usa una columna de vidrio llena de cuentas hechas de diferentes materiales. Las mezclas que se fuerzan a través de la columna tienen productos químicos que se unen con diferentes fuerzas a las cuentas. La fuerza de la unión, que depende de la similitud en la polaridad, determina cuánto tiempo la sustancia química se unirá a la cuenta antes de ser liberada. Algunos compuestos se unen tan fuertemente que esencialmente nunca se liberan de las perlas en la columna y nunca se miden en la solución que sale de la columna.
Costo
Las técnicas típicas de separación de laboratorio implican desarrollar un ensayo o método de separación y luego implementar ese ensayo para separar compuestos individuales de una solución. Sin embargo, esto generalmente da como resultado múltiples soluciones que también deben someterse a procedimientos, lo que lleva a un aumento exponencial de la complejidad. Aunque la HPLC a menudo puede simplificar y acelerar este proceso, el costo de desarrollar un aparato de HPLC puede llegar a ser tremendo. El desarrollo de un aparato de HPLC, aunque mucho más eficiente, es mucho más costoso que el desarrollo de otros ensayos para separar compuestos. Esto hace que no sea financieramente viable para muchos pequeños laboratorios privados.
Complejidad
La HPLC no solo se usa para separar compuestos simples, también se usa para aislar proteínas específicas de una mezcla celular. En este caso, las cuentas en la columna generalmente están recubiertas con un anticuerpo específico para la proteína que necesita recolectar. Las proteínas se unen a los anticuerpos y la solución restante se pasa a través de la columna, luego las proteínas se liberan usando otra solución y se recogen. Esto requiere un técnico altamente calificado para monitorear la columna en todo momento y asegurarse de que el proceso se ejecute exactamente como se planificó.