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Cuantifique su muestra de ARN midiendo su absorbancia de luz ultravioleta (UV). Un espectrofotómetro de nano-gota usará solo uno o dos microlitros de su muestra, que puede recuperar. Otros espectrofotómetros requieren una muestra mucho más grande. El coeficiente de extinción para nucleótidos a una longitud de onda UV de 260 nm en una trayectoria de luz de 1 cm es 20. Según este coeficiente de extinción, la absorbancia de 40 µg / ml de ARN en las mismas condiciones es uno. Con esta información, puede calcular la concentración de su muestra de ARN.
Haga una dilución, si es necesario, de su muestra. Una dilución estándar para una microcubeta es 1:40. Haga esta dilución agregando 2 µL de muestra de ARN a 78 µL de agua estéril.
Siga los protocolos de su espectrofotómetro particular para calibrar la máquina usando un blanco y luego determine la densidad óptica de su muestra a una longitud de onda UV de 260 nm.
Multiplique la absorbancia de su muestra por su factor de dilución por 40 μg de ARN / ml. La ecuación sería: “Concentración de ARN (µg / ml) = (OD260) x (factor de dilución) x (40 µg de ARN / ml) / (1 unidad OD260)” (Hofstra.edu) Por ejemplo: si diluyó su muestra por 1:40 y su lectura de absorbancia fue 0.08, usted multiplicaría 0.08 x 40 x 40 = 128 µg / ml = 0.13 µg / μL
Calcule la pureza de su muestra tomando otra lectura de absorbancia a una longitud de onda UV de 280 nm. La relación OD 260 / OD 280 indicará si, y a qué nivel, su muestra está contaminada con proteínas o fenol. Un resultado de 1.8 a 2.0 indica ARN de calidad.