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Cuando se trabaja con cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), una buena calibración es absolutamente esencial para garantizar resultados confiables y de calidad. La calibración adecuada de un instrumento HPLC comienza con la fabricación de un estándar de calibración adecuado. En la mayoría de los casos, la calibración de hecho requiere una serie de estándares de concentración creciente para producir lo que se conoce como curva de calibración. Esta es una línea trazada y una ecuación asociada que describe la relación entre la concentración del químico que se está probando y la respuesta del detector de HPLC.
Determine la sustancia química que desea probar para usar el HPLC (el "analito"). Por ejemplo, es posible que desee probar una serie de refrescos para el contenido de fructosa, en cuyo caso la fructosa sería el analito.
Obtenga una cantidad del analito químico de pureza adecuada. Normalmente, la pureza debe ser superior al 99% y el analito debe comprarse en una empresa de suministros químicos de buena reputación. En el caso de la fructosa, por ejemplo, compraría fructosa pura de un vendedor de productos químicos y no de una tienda de comestibles.
Determine las concentraciones máximas y mínimas anticipadas del analito en las muestras que pretende analizar en la HPLC. En el caso de los refrescos, examinaría las etiquetas de las bebidas y determinaría el contenido de fructosa más bajo y más alto entre las bebidas que probará. Tenga en cuenta que la muestra inicial (el refresco) puede diluirse o manipularse de otro modo durante la preparación para el análisis (dependiendo del método de HPLC utilizado) y, por lo tanto, la concentración de analito en las muestras realmente inyectadas en la HPLC puede modificarse. Es la concentración de analito en las muestras que se ejecuta en la HPLC lo que debe considerarse.
Determine el disolvente en el que disolverá su analito para completar los estándares de calibración. Este solvente debe poder disolver adecuadamente el analito en un rango relativamente amplio de concentración (al menos tan alto como en las muestras que pretende analizar). Además, este disolvente idealmente debería ser bastante similar a la "fase móvil": el disolvente utilizado para transportar muestras a través del instrumento HPLC.
Calcule la cantidad de analito requerida para hacer una solución "estándar de stock" del analito. Esto se encuentra multiplicando la concentración requerida del patrón estándar por el volumen deseado. La concentración del analito en esta solución debe ser al menos un 10% más alta que la concentración de muestra más alta anticipada. Si la concentración de fructosa más alta anticipada en una muestra de refresco es de 8 gramos / 100 mililitros, entonces el estándar de stock podría hacerse a una concentración de 10 gramos de fructosa / 100 mililitros. Un volumen razonable es de 500 mililitros, por lo tanto se requerirían 8/100 ml x 500 ml = 40 gramos de fructosa.
Pese la cantidad requerida de analito a un nivel adecuado de precisión. A menudo, un valor de peso en gramos con precisión de uno o dos decimales es adecuado, pero puede ser necesaria una mayor precisión para algunos métodos.
Transfiera el analito pesado a un matraz volumétrico del volumen necesario y agregue el solvente deseado a la marca de llenado en el matraz. El uso de un matraz volumétrico (por ejemplo, en lugar de un vaso graduado) aumenta la precisión del valor de concentración estándar del stock. Asegúrese de que todo el analito se transfiera al matraz; use un poco de solvente para lavarlo, si es necesario.
Tapar el matraz volumétrico y agitar suavemente o invertir hasta que el analito se disuelva por completo.
Haga una serie de diluciones variables del patrón estándar transfiriendo volúmenes conocidos del patrón estándar en matraces volumétricos, usando pipetas para una transferencia precisa y luego agregando solvente. La concentración estándar más baja debe estar por debajo de la muestra anticipada más baja a analizar. En el ejemplo de los refrescos, si la concentración de fructosa más baja esperada en una muestra es de 2 gramos / 100 ml, entonces se podría hacer un estándar de 1 gramo / 100 ml. Esto se haría mediante una dilución diez veces mayor del estándar de existencias. La serie estándar debería incluir un total de 5 o 6 concentraciones, por lo que se requerirían diluciones adicionales para producir estándares de quizás 3, 5 y 8 gramos de fructosa / ml. Ahora tiene una serie de soluciones estándar con las que calibrar el HPLC.